Постановка рта. Реакція гальмування гемаглютинації (рту)

В основі РГА лежить здатність еритроцитів склеюватись при адсорбції на них певних антигенів. Як досліджуваний матеріал при гемаглютинації використовують алантоїсну, амніотичну рідину, суспензію хоріоналлантоісних оболонок курячих ембріонів, суспензії та екстракти з культур або органів тварин, заражених вірусами, нативний інфекційний матеріал. РДА не є серологічною, оскільки відбувається без участі імунної сироватки та використовується для вибору робочого розведення антигену для постановки РТГА або наявності антигену (вірусу) у досліджуваному матеріалі (наприклад, при грипі). У реакції використовуються еритроцити тварин, птахів, людини I(0) групи крові.

Для встановлення орієнтовної РДА на предметне скло наносять краплю 5% суспензії еритроцитів і краплю випробуваного матеріалу, ретельно змішують. При позитивному результаті через 1-2 хвилини макроскопічно спостерігають появу пластів'ї аглютинації еритроцитів.

Для постановки РДА в розгорнутому ряду в лунках полістеролових планшетів готують дворазово розведення досліджуваного матеріалу на фізіологічному розчині в обсязі 0,5 мл. У всі пробірки вносять по 0,5 мл 0,25 - 1% суспензії еритроцитів. Результати враховують після повного осідання еритроцитів у контролі (еритроцити + фізіологічний розчин). Реакцію враховують характером осаду еритроцитів. У позитивних випадках рівень аглютинації відзначають плюсами. Чотирьома плюсами оцінюють реакцію, що має вигляд тонкої плівки з склеєних еритроцитів значок еритроцитів відповідає одному плюсу. Різко окреслений осад еритроцитів, що не відрізняється від контролю, показує відсутність аглютинації. За титр приймають граничне розведення досліджуваного матеріалу, що спричинило аглютинацію еритроцитів на два плюси.

За позитивного результату РГА дослідження продовжують, визначаючи тип виділеного вірусу за допомогою реакції гальмування гемаглютинації типоспецифічними сироватками.

РТГА заснована на властивості антисироватки пригнічувати вірусну гемаглютинацію, оскільки нейтралізований специфічними антитілами вірус втрачає здатність аглютинувати еритроцити. При орієнтовному типуванні вірусів використовують краплинний метод на склі. Для остаточного встановлення типової приналежності виділеного вірусу та титрування антитіл у сироватках ставлять розгорнуту РТГА у пробірках або у лунках. З цією метою готують дворазові розведення сироваток на фізіологічному розчині та розливають по 0,25 мл. До розведення сироватки додають по одній краплі матеріалу, що містить вірус і по одній краплі 1% суспензії еритроцитів.

При використанні РТГА для визначення типу вірусу використовують типоспецифічні сироватки, які додають до рівного обсягу робочого розведення антигену. Типову приналежність виділеного вірусу встановлюють за специфічною імунною сироваткою, що показала найвищий титр антитіл до цього вірусу.

РГА та РТГА широко застосовується для діагностики вірусних інфекцій (кліщовий енцефаліт, грип та ін.) з метою виявлення специфічних антитіл та для ідентифікації багатьох вірусів за їхніми антигенами.

Зміст теми "Реакції преципітації (РП). Імуноелектрофорез. Складні реакції імунодіагностики.":

Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА). Незважаючи на свою назву, принцип реакції багато в чому аналогічний РН вірусів, оскільки заснований на здатності AT пов'язувати різні віруси та нейтралізувати їх, позбавляючи можливості аглютинувати еритроцити. Візуально цей ефект і проявляється у «гальмуванні» гемаглютинації. РТГА застосовують при діагностиці вірусних інфекцій для виявлення специфічних антигемагглютинінів та ідентифікації різних вірусів за їх гемагглютиніном, що виявляє властивості Аг.

Реакції іммобілізації

Реакції іммобілізаціїзасновані на здатності специфічних AT, що циркулюють у сироватці хворих, пригнічувати (нейтралізувати) рухливість різних мікроорганізмів.

На практиці застосування знайшли реакції іммобілізаціїблідої трепонеми та холерного вібріона.

Реакції імунного лізису

Специфічні AT взаємодіють з різними клітинами, у тому числі бактеріями та найпростішими, що призводить до активації системи комплементу за класичним шляхом та подальшим лізисуклітин.

Серед реакцій імунного лізисунайбільш відомі реакції вібріолізу та реакції гемолізу.

№ 83 Імуноферментний аналіз, імуноблотінг. Механізм, компоненти, застосування.
Імуноферментний аналізабо метод - виявлення антигенів за допомогою відповідних антитіл, кон'югованих з ферментом-міткою (пероксидазою хрону, бета-галактозидазою або лужною фосфатазою). Після з'єднання антигену з міченою ферментом імунною сироваткою суміш додають субстрат/хромоген. Субстрат розщеплюється ферментом і змінюється колір продукту реакції - інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості молекул антигену і антитіл, що зв'язалися. ІФА застосовуютьдля діагностики вірусних, бактеріальних та паразитарних хвороб, зокрема для діагностики ВІЛ-інфекцій, гепатиту В та ін., а також визначення гормонів, ферментів, лікарських препаратів та інших біологічно активних речовин, що містяться у досліджуваному матеріалі у мінорних концентраціях (10 10 -10 12 г/л).

Твердофазний ІФА- варіант тесту, коли один із компонентів імунної реакції (антиген або антитіло) сорбований на твердому носії, напр., у лунках полістиролових планшеток. Компоненти виявляють додаванням мічених антитіл чи антигенів. За позитивного результату змінюється колір хромогену. Щоразу після додавання чергового компонента з лунок видаляють реагенти, що не зв'язалися шляхом промивання,

I. При визначенні антитіл (лівий малюнок) у лунки планшеток з сорбованим антигеном послідовно додають сироватку крові хворого, антиглобулінову сироватку, мічену ферментом, та субстрат/хромоген для ферменту.

ІІ. При визначенні антигену (правий малюнок) в лунки з сорбованими антитілами вносять антиген (напр., сироватку крові з шуканим антигеном), додають діагностичну сироватку проти нього та вторинні антитіла (проти діагностичної сироватки), мічені ферментом, а потім субстрат/хромоген для ферменту.

Конкурентний ІФАдля визначення антигенів: шуканий антиген та мічений ферментом антиген конкурують один з одним за зв'язування обмеженої кількості антитіл імунної сироватки.

Інший тест - Конкурентний ІФА для визначення антитіл: шукані антитіла та мічені ферментом антитіла конкурують один з одним за антигени, сорбовані на твердій фазі.

Імуноблот- Високочутливий метод виявлення білків, заснований на поєднанні електрофорезу та ІФА або РІА. Імуноблоттинг використовують як діагностичний методпри ВІЛ-інфекції та ін.

Антигени збудника розділяють за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі, потім переносять їх з гелю на активований папір або нітроцелюлозну мембрану і виявляють за допомогою ІФА. Фірми випускають такі смужки із «блотами» антигенів. На ці смужки наносять сироватку хворого . Потім, після інкубації, відмивають від антитіл хворого, що не зв'язалися, і наносять сироватку проти імуноглобулінів людини, мічену ферментом . Комплекс [антиген + антитіло хворого + антитіло проти Ig людини], що утворився на смужці, виявляють додаванням хромогенного субстрату, що змінює забарвлення під дією ферменту.

Принцип РТГАполягає в тому, що в пробірці змішують рівні обсяги сироватки крові та суспензії вірусу і після експозиції визначають, чи зберігся в суміші вірус шляхом додавання суспензії еритроцитів. Аглютинація еритроцитів вказує на наявність, а відсутність гемаглютинації – відсутність вірусу в суміші. Зникнення вірусу із суміші вірус + сироватка розцінюється як ознака взаємодії антитіл сироватки та вірусу.

Але антитіла з антигенами взаємодіють у певних кількісних співвідношеннях. Тому, щоб певна кількість вірусу була позбавлена гемагглютинирующей здатності, потрібен певний мінімум антитіл, оскільки один із компонентів РТГА завжди невідомий, доводиться реакцію ставити у ряді пробірок з різними дозами антитіл і однаковими дозами вірусу або навпаки. Це досягається тим, що беруть або різні розведення сироватки і те саме розведення вірусу, або різні розведення вірусу і те саме розведення сироватки.

РТГА дозволяє вирішувати такі завдання: визначати титр антитіл до гемагглютинуючого вірусу в сироватці; ідентифікувати невідомий гемагглютинуючий вірус за відомими сироватками; встановити ступінь антигенної спорідненості двох вірусів.

Переваги РТГА:простота техніки, швидкість, не потрібна стерильна робота, специфічність, дешевизна. Недолік: РТГА можлива лише з гемагглютинуючими вірусами.

Принцип титрування антитіл у РТГАполягає в наступному:

- готують ряд послідовних (зазвичай 2-кратних) розведень досліджуваної сироватки в однакових обсягах (частіше 0,25 або 0,2 мл);

– до кожного розведення додають такі ж обсяги гомологічного вірусу у титрі 4 ДАЄ;

– суміші витримують певний час за певної температури (для вірусу ньюкаслської хвороби 40–60 хв при кімнатній температурі);

- до всіх сумішей додають рівні обсяги 1% суспензії відмитих еритроцитів;

– після експозиції оцінюють гемаглютинацію у кожній суміші у хрестах.

У реакції передбачаються контролі сироватки, вірусу та еритроцитів.

Те найвище розведення сироватки, яке ще повністю гальмує гемаглютинацію, сприймається як показник титру антитіл у цій сироватці.

Використання у вірусології реакції гемадсорбції.

РДАд.Гемадсорбція – поєднання еритроцитів з поверхнею уражених вірусом клітин – вперше було виявлено Фогелем і Щелоковим (1957) на культурі тканини, інфікованої вірусом грипу. В основі цього явища лежить кревність рецепторів вірусу, що знаходяться на поверхні ураженої клітини, з рецепторами еритроциту, що призводить до їх взаємного зчеплення аналогічно реакції гемаглютинації. Перевага цієї реакції полягає в тому, що вона стає позитивною ще до появи чітких цитопатичних змін в інфікованих клітинах.

Методика РДАдполягає у наступному. На 3-4-й день після інфікування клітин беруть дві пробірки з однаковою культурою клітин, з яких одна заражена матеріалом, що містить вірус, а друга контрольна. З обох пробірок зливають культуральну рідину і вносять в обидві по 2-3 краплі 0,5% суспензії відмитих еритроцитів. Обидві пробірки залишають на 5-10 хв так, щоб еритроцити були на поверхні клітин (кладуть горизонтально на стіл), а потім трохи споліскують фізрозчином і досліджують під мікроскопом (мале збільшення). У контрольній пробірці еритроцити повністю видаляються з фізрозчином, а деякі з тих, що залишилися, пливуть разом з рідиною. Якщо в зараженій пробірці еритроцити не пішли з фізрозчином і не пливуть, а прикріплені до поверхні клітин, слід вважати РГАд позитивною.

Залежно від вірусу та виду клітин розташування еритроцитів може бути трояким:

– еритроцити адсорбовані лише з периферії клітинного пласта як «намиста» (вірус африканської чуми свиней);

– еритроцити розташовані на шарі клітин вогнищами або скупченнями (вірус грипу);

– еритроцити розташовані на шарі клітин дифузно (вірус парагрипу).

Кожен вірус здатний адсорбувати еритроцити крові тварин певних видів.

Серологічна діагностика вірусних хвороб щодо приросту титру антитіл у парних сироватках крові.

Реакція гемаглютинації (РГА) та реакція гальмування гемаглютинації (РТГА), механізм, компоненти та застосування реакцій.

В основі реакції гемаглютинації лежить феномен склеювання еритроцитів, що відбувається під впливом різних факторів. Розрізняють пряму та непряму гемаглютинацію.

Спочатку еритроцити відмивають ізотоничним розчином хлориду натрію, потім при необхідності (при використанні антигенів білкової природи) їх обробляють розчином таніну 1: 20000 і сенсибілізують розчинними антигенами. Після відмивання буферним ізотонічним розчином натрію хлориду еритроцитарний антиген готовий до вживання.

Досліджувані сироватки розводять ізотоничним розчином хлориду натрію в пробірках або спеціальних пластмасових пластинках з ямочками, потім до кожного розведення сироватки додають еритроцитарний діагностикум. Результати реакції непрямої гемаглютинації враховують характером осаду еритроцитів, що утворився на дні пробірки. Позитивним вважають результат реакції, у якому еритроцити поступово покривають все дно пробірки. При негативній реакції еритроцити у вигляді маленького диска або «гудзика» розташовуються в центрі дна пробірки

Основні компоненти РП:

А) розчинний антиген,

Б) Специфічні антитіла (сироватка)

(РТГА) - метод ідентифікації вірусу або виявлення противірусних антитіл у сироватці крові хворого, заснований на феномен відсутності аглютинації еритроцитів препаратом, що містить вірус, у присутності імунної до нього сироватки крові.
заснована на блокаді, придушенні антигенів вірусів антитілами імунної сироватки, внаслідок чого віруси втрачають властивість аглютинувати еритроцити.

РТГА застосовують для діагностики багатьох вірусних хвороб, збудники яких (віруси грипу, кору, краснухи, кліщового енцефаліту та ін) можуть аглютинувати еритроцити різних тварин.
Механізм.Типування вірусу проводять у реакції гальмування гемаглютинації (РТГА) з набором типоспецифічних сироваток. Результати реакції враховують за відсутністю гемаглютинації. Підтипи вірусу А з антигенами H0N1, H1N1, Н2N2, H3N2 та ін.

можуть бути диференційовані в РТГА з набором гомологічних типоспецифічних сироваток.

В основі реакції гемаглютинації лежить феномен склеювання еритроцитів, що відбувається під впливом різних факторів.

Розрізняють пряму та непряму гемаглютинацію.
При реакції прямої гемаглютинації відбувається склеювання еритроцитів при адсорбції певних антигенів, наприклад вірусів.
У серологічних дослідженнях застосовують реакцію гальмування прямої гемаглютинації, коли виділений у хворого вірус нейтралізують специфічною сироваткою імунної, а потім з'єднують з еритроцитами.

Відсутність гемаглютинації говорить про відповідність вірусу та імунної сироватки.

Реакція непрямої гемаглютинації (пасивна гемаглютинація) спостерігається в тих випадках, коли до еритроцитів, заздалегідь оброблених (сенсибілізованими) різними антигенами, додають імунну сироватку або сироватку хворого, що має відповідні антитіла.

Відбувається специфічне склеювання еритроцитів, їх пасивна гемаглютинація.

Реакція непрямої, або пасивної, гемаглютинації за чутливістю та специфічністю перевершує інші серологічні методи, та її використовують при діагностиці інфекцій, спричинених бактеріями, рикетсіями, найпростішими.

Методика постановки реакції непрямої гемаглютинації складається з кількох етапів.

Після відмивання буферним ізотонічним розчином натрію хлориду еритроцитарний антиген готовий до вживання. Досліджувані сироватки розводять ізотоничним розчином хлориду натрію в пробірках або спеціальних пластмасових пластинках з ямочками, потім до кожного розведення сироватки додають еритроцитарний діагностикум.

Результати реакції непрямої гемаглютинації враховують характером осаду еритроцитів, що утворився на дні пробірки. Позитивним вважають результат реакції, у якому еритроцити поступово покривають все дно пробірки. При негативній реакції еритроцити як маленького диска чи «гудзики» розташовуються у центрі дна пробірки.

Реакція гальмування гемаглютинації- серологічна реакція, заснована на здатності антитіл запобігати аглютинації еритроцитів гемагглютинуючими видами вірусів (аденовірусами, арбовірусами, деякими ентеровірусами, вірусами грипу та парагрипу, кору, реовірусами).

Специфічні антивірусні антитіла взаємодіють з поверхневими молекулами гемагглютинінів віріонів цих вірусів і блокують їх зв'язування з комплементарними молекулами мембрани еритроцитів.

Використовують дещо обмежено через наявність у сироватці крові людей неспецифічних інгібіторів вірусів, а також природних антитіл - аглютинінів.

Реакція нейтралізації – реакція гальмування гемаглютинації (РТГА).

РТГА застосовується:
-Для серотипування вірусів;
-для серодіагностики інфекцій.
Виділяють два способи постановки:
- Краплинний спосіб на склі (орієнтовна реакція), застосовується для сіро копіювання вірусів;
- Розгорнутий у пробірках.

Механізм.

Деякі віруси (наприклад, грип) мають гемаглютинін, що викликає аглютинацію еритроцитів різних тварин, залежно від виду вірусу.

За наявності в сироватці антитіл - антигемагглютинінів спостерігаються інгібування активності вірусів.
РТГА.
Ціль: серотипування вірусу грипу А

Компоненти:
1. Досліджуваний матеріал - алантоїсна рідина курячого ембріона,
2. Діагностичні протигрипозні типоспецифічні сироватки,
3. 5% завись курячих еритроцитів.
4.

Фізіологічний розчин.

Реакція ставиться на склі крапельним способом. На скло наносять по 1 краплі діагностичних сироваток та досліджуваного матеріалу, перемішують, потім додають 1 краплю суспензії еритроцитів. При позитивній реакції спостерігається гомогенне почервоніння, а при негативному випаданні пластівців червоного кольору (гемаглютинація).

Попередня31323334353637383940414243444546Наступна

Характеристика вірусів грипу. Епідеміологія та діагностика грипу. Використання РТГА для серотипування вірусів грипу. Препарати для специфічної профілактики та лікування.

Грип чи інфлюенца – гостре інфекційне захворювання, що характеризується ураженням слизових оболонок верхніх дихальних шляхів, лихоманкою, загальною інтоксикацією, порушенням діяльності серцево-судинної та нервової систем

Грип відрізняється схильністю до епідемічного та пандемічного поширення завдяки високій контагіозності та мінливості збудника.

Характеристика збудників. Збудники – віруси грипу належить до цього. Orthomyxoviridae, родам Influenzavirus А, В та Influenzavirus С. Віруси грипу - це РНК-віруси. Вірус грипу типу А було виділено у 1933 р. У. Смітом, К. Ендрюсом, П. Лейдлоу. У 1940 р. Т.

Застосування методу гемаглютинації у вірусології.

Френсіс і Р. Меджіл виділили віруси грипу типу В, в 1949 р. Р. Тейлор - типу С. У Росії перші віруси грипу були виділені в 1936 р. А. А. Смородинцевим і віднесені до типу А. Морфологія. Віруси грипу мають сферичну форму (форму кулі) – 80 – 120 нм, рідше мають ниткоподібну форму. Складаються з: 1) серцевина - нуклеокапсид спірального типу симетрії (однонитчаста лінійна "-"-нитка РНК + білковий капсид); 2) базальна мембрана – зовнішня ліпопротеїдна оболонка – суперкапсид.

На поверхні оболонки знаходяться глікопротеїди (у вигляді шипів та ворсинок) 2-х типів: 1) гемаглютинін – сприяє прикріпленню до рецепторів клітини; 2) нейрамінідаза – сприяє звільненню вірусу з клітини. Культивування. Для культивування використовують курячі ембріони, первинно трипсинізовані культури клітин, іноді лабораторних тварин.

Найзручнішою моделлю є курячі ембріони 10-12-денного віку. Вона дозволяє отримати велику кількість вірусу, що необхідно при виробництві вакцин та бакпрепаратів.

Зараження виробляють в аллонтоісную порожнину, хоріон-аллонтоисную оболонку, в амніотичну порожнину, в амніон. Наявність вірусу в курячому ембріоні виявляють у реакції гемаглютинації. Антигенна структура. Віруси мають внутрішній антиген - S і поверхневі антигени: НА-гемаглютинін та NA-нейрамінідазу. S-антиген — групоспецифічний, загальний для цілого типу, тому антигену віруси грипу діляться на типи А, В і С. Це комплементзв'язуючий, стабільний (незмінний) антиген.

НА та NA-антигени – це специфічні антигени. НА-антиген викликає утворення віруснейтралізуючих антитіл та склеювання еритроцитів.

NA-антиген викликає утворення антитіл, що частково нейтралізують віруси.

Вірус типу менш мінливий, а тип С відрізняється високою стабільністю.

Токсичні властивості. Токсична дія вірусу на організм ( головний біль, м'язові болі, температура, катаральні явища) обумовлено білками вірусу (найвіруснішою частинкою). Ця дія строго специфічна і нейтралізується лише імунною сироваткою відповідного типу або підтипу або сироваткою перехворілих. резистентність. Віруси грипу чутливі до дії УФ-променів, дез.речовин (формаліну, спирту, фенолу, хлораміну) та до жиророзчинників.

У рідкому середовищі гинуть при температурі 50 - 60 ° С протягом декількох хвилин. При кімнатній температурі у повітрі віруси зберігають інфекційні властивості кілька годин. Довго зберігаються у висушеному вигляді, а в замороженому стані (- 70°С) не лише довго зберігаються, а й не втрачають вірулентності.

Сприйнятливість тварин. У природних умовах віруси типу А вражають людину і тварин (хворіють на коні, свині), а віруси типів В і С — тільки людину. Серед лабораторних тварин до вірусів чутливі білі миші, африканські тхори, сирійські хом'яки, мавпи.

Захворювання у тварин характеризується ураженням легенів, гарячковим станом і може закінчитися загибеллю тварин. Епідеміологія захворювання. Джерело інфекції - хвора людина з клінічно вираженою або безсимптомною формою. Хвора людина виділяє вірус у навколишнє середовищепри кашлі, розмові, чханні з краплями слини, слизу, мокротиння вже в інкубаційний період.

Хворий стає заразним за 24 години до появи основних симптомів і становить епідемічну небезпеку протягом 48 годин після їх зникнення.

Механізм передачі – аерогенний. Шлях передачі повітряно-краплинний. Сприйнятливість людей до грипу дуже висока. Хворіють усі вікові групи, переважно у зимовий час. Найбільш сприйнятливі діти та особи похилого віку. У назві захворювання відображено особливості епідеміології: грип від франц. gripper - хапати, інфлюенца - від італ. Influenza di freddo – вплив холоду.

З усіх гострих респіраторних захворювань грип – найбільш масове та тяжке захворювання. Пандемії та епідемії грипу охоплюють до 30-50% і більше населення земної кулі, завдаючи величезних збитків здоров'ю та економіці країн. Перші описи епідемій грипу відносяться до 12-14 ст. Виникнення пандемій та великих епідемій викликає вірус грипу типу А, що обумовлено високою мінливістю вірусу та пов'язане з появою нового підтипу внаслідок шифту антигенів.

Між пандеміями кожні 1,5-2 роки виникають епідемічні спалахи, що з антигенним дрейфом вірусів. У 1918 р. пандемію грипу «іспанки» (захворіло 1,5 млрд. чол., померло 20 млн. чол.) викликав вірус грипу типу А1 Первинно зареєстрована Іспанії, ця пандемія охопила майже все населення Землі; захворювання характеризувалося розвитком винятково важких геморагічних пневмоній із рекордним показником смертності (до 1% від усіх випадків).

У 1957 р. «азіатську» пандемію (захворіло 2 млрд. чол.) викликав новий підтип – підтип А2. У 1968 р. «гонконзька» пандемія (захворів 1 млрд. чол.) була викликана підтипом, що знову виник, — підтипом А3. Як правило, новий варіант вірусу витісняє з людської популяції ранній різновид, що рано циркулював.

Але 1977 р. після 20-річної перерви несподівано «повернувся» тип А1, що призвело до виникнення великої епідемії. Отже, витіснені варіанти вірусу грипу зберігаються і через певні проміжки часу можуть знову спричинити епідемію. Вірус типу викликає локальні епідемії, а тип епідемій не викликає. Патогенез та клініка захворювання. Вхідні ворота – верхні дихальні шляхи. Вірус впроваджується в епітеліальні клітини слизової оболонки та розмножується в них.

Вплив вірусу на епітеліальні клітини викликає їх некроз і злущування (відторгнення) епітелію, внаслідок чого слизова оболонка стає проникною для вірусів та бактерій. Вони проникають у кров і поширюються по всьому організму» Вірусемія супроводжується численними ураженнями ендотелію капілярів з підвищенням їхньої проникності.

У важких випадках спостерігаються великі крововиливи у легенях, міокарді, паренхіматозних органах. Продукти розпаду пошкоджених клітин та вірусні білки надають токсичну дію на різні органи та системи органів. Токсини вірусу сильно пригнічують ЦНС, і, хоча процес триває недовго (3 - 5 днів), хвора людина ще довго залишається ослабленою і до ослабленого організму приєднується якась вторинна інфекція і виникають ускладнення: грипозні пневмонії, гострий набряк легень, ураження нирок , серця, бронхів.

Часте ускладнення грипу - бактеріальні пневмонії (стрептококи групи В). Під час пандемії «іспанки» люди вмирали переважно від вторинних бактеріальних пневмоній.

У патогенезі грипу має значення як інтоксикація, а й алергізація, і навіть порушення функціональних властивостей імуннокомпетентних клітин із недостатнім розвитком імунодефіциту. Інкубаційний період- Кілька годин - 1-3 діб. Характерно гострий початок, підвищення температури до 37,5 - 38 ° С, загальна інтоксикація, що виражається в нездужання, головного болю, болі в очних яблуках, запальних процесах дихальних шляхів різного ступеня тяжкості (риніти, ларингіти, трахеїти, фарингіти).

Гарячковий стан при грипі без ускладнень триває 5-6 днів. Імунітет. Після перенесеного захворювання формується типоспецифічний та штаммоспецифічний імунітет, який забезпечується специфічними та неспецифічними клітинними та гуморальними факторами. Велике значення мають антитіла Ig А. Перехресний імунітет не розвивається, після перенесення грипу типу А1, можна захворіти на грип типу А2 і т.д. Після вірусу типу імунітет –1-2 роки, після вірусу типу В – 3 – 5 років.

Пасивний природний імунітет – у дітей до 8 – 11 міс. Через високу антигенну мінливість вірусу одужання не призводить до розвитку стійкої несприйнятливості до повторних заражень.

Лабораторна діагностика. Досліджуваний матеріал: мазки-відбитки зі слизової оболонки носової порожнини, що відокремлюється носоглотки, шматочки легень, мозку при летальних наслідках.

Методи діагностики: 1) метод циториноскопії – виявлення внутрішньоклітинних включень, специфічних для вірусу – при фарбуванні піоктаніном під мікроскопом видно яскраво-червоні включення вірусу грипу в клітинах війного епітелію; 2) вірусологічний метод – виділення вірусу грипу з організму людини шляхом зараження курячих ембріонів змивом із носоглотки хворого; індикацію (присутність) вірусу проводять за допомогою РДА (віруси грипу аглютинують еритроцити людини та різних тварин), ідентифікацію вірусу проводять поетапно: тип визначають у РСК, підтип гемаглютиніну – у РТГА, а підтип нейрамінідази – у реакції інгібування активності; 3) серологічний метод - виявлення наростання титру (в 4 рази) специфічних антитіл у сироватці крові хворого за допомогою РЗК, РТГА, РН у культурі клітин, реакції преципітації в гелі, ІФА; 4) біологічний метод – інтраназальне зараження мишей – введення матеріалу в легені під ефірним наркозом; миші гинуть через 2 – 3 дні внаслідок пневмонії; 5)експересс-діагностика - Виявлення вірусного антигену за допомогою РІФ.

Лікування та профілактика.

Для профілактики та лікування у перші дні хвороби застосовують людський лейкоцитарний інтерферон (інтраназально). З лікувальною метою використовують противірусні препарати — ремантадин (грип типу А), адапромін, візазол та імуномодулюючі препарати — дибазол, продігіозан, левомізол.

При тяжкому перебігу грипу, особливо у дітей, застосовують донорський протигрипозний імуноглобулін, а також препарати – інгібітори клітинних протеаз (гордокс, контрикал, амінокапронова кислота).

Спецпрофілактика. Використовуються перелічені противірусні препарати та імуномодулятори, а також вакцини – живі та інактивовані: 1) живі моновакцини для перорального застосування – аттенуйовані штами вірусів, що циркулюють нині (А1, А3 та В); виявляють найбільшу імуногенність; 2) цільновірійні вакцини з вірулентних штамів, інактивованих формальдегідом або УФ-променями; 3) субодиничні грипозні вакцини тільки з поверхневих антигенів - НА і NA-антигенів (мають мінімальну реактогенність).

Для отримання вакцин віруси культивують у курячих ембріонах та на культурі клітин курячих ембріонів.

При введенні вакцин формується місцевий та гуморальний імунітет. Вакцинацію здійснюють у періоди найбільшого ризику розвитку епідемій. Вона більшою мірою показана особам молодшого та похилого віку. Застосування вбитих вакцин потребує щорічної ревакцинації; їхня ефективність не перевищує 60 — 70%.

Т.к. часто спостерігаються антигенні варіації збудника, набір антигенів відповідного вірусу для імунізації може бути визначений тільки після початку спалаху захворювання.

Білет 15.

Реакція гемаглютинації (РДА).

У лабораторії користуються двома різними механізмом дії реакціями гемаглютинації.

Перша РДА належить до серологічних. У цій реакції еритроцити аглютинуються при взаємодії з відповідними антитілами (гемаглютинінами).

Реакцію широко використовують визначення груп крові.

Друга РДА не є серологічною. У ній склеювання еритроцитів викликають не

антитіла, а особливі речовини, які утворюються вірусами. Наприклад, вірус грипу аглютинує еритроцити курей та морських свинок, вірус поліомієліту – еритроцити барана. Ця реакція дозволяє будувати висновки про наявність тієї чи іншої вірусу в досліджуваному матеріалі.

Реакцію проводять у пробірках або спеціальних пластинках з лунками.

Досліджуваний на наявність вірусу матеріал розводять ізотоничним розчином від 1:10 до 1:1280; 0,5 мл кожного розведення змішують з рівним обсягом 1-2% суспензії еритроцитів. У контролі 0,5 мл еритроцитів змішують із 0,5 мл ізотонічного розчину. Пробірки ставлять на 30 хвилин термостат, а пластини залишають при кімнатній температурі на 45 хвилин.

Облік результатів.При позитивному результаті реакції на дні пробірки або лунки випадає осад еритроцитів з фестончастими краями (парасолька), що покриває все дно лунки.

Реакція гальмування гемаглютинації

При негативному результаті еритроцити утворюють щільний осад з рівними краями (гудзик). Такий самий осад має бути у контролі.

Інтенсивність реакції виражають знаками "+". Титром вірусу є максимальне розведення матеріалу, в якому відбувається аглютинація.

Реакція гальмування гемаглютинації

Це серологічна реакція, у якій специфічні противірусні антитіла, взаємодіючи з вірусом (антигеном), нейтралізують його та позбавляють здатності аглютинувати еритроцити, т.е.

е. гальмують реакцію гемаглютинації. Ця реакція дозволяє визначити вид та тип вірусів.

Постановка реакції. 0,25 мл противірусної сироватки змішують з рівним обсягом матеріалу, що містить вірус. Суміш струшують і поміщають у термостат на 30 хвилин, після чого додають по 0,5 мл 1-2% суспензії еритроцитів.

Облік результатів.При правильній постановці досвіду в контролі сироватки та еритроцитів має утворитися «гудзик» — немає аглютинуючого еритроцити фактора; у контролі антигену утворюється парасолька - вірус викликав аглютинацію еритроцитів.

Якщо сироватка гомологічна вірусу, що вивчається, утворюється «гудзик» — сироватка нейтралізувала вірус.

Реакція непрямої гемаглютинації

Реакція непрямої (пасивної) гемаглютинації (РІГА) заснована на тому, що еритроцити, якщо на їхній поверхні адсорбувати розчинний антиген, набувають здатності аглютинуватися при взаємодії з антитілами до адсорбованого антигену.

Постановка реакції.

Сироватку прогрівають 30 хвилин при 56 °С, послідовно розводять у співвідношенні 1:10 - 1:1280 і розливають по 0,25 мл у пробірки або лунки, куди потім додають по 2 краплі еритроцитів з адсорбованими на них антигенами.

Контролі:завись еритроцитів з адсорбованими на них антигенами із свідомо імунною сироваткою, завись еритроцитів з адсорбованими на них антигенами з нормальною сироваткою; завись нормальних еритроцитів з випробуваною сироваткою.

У першому контролі має відбутися аглютинація, у другому та третьому її не повинно бути.

Контрольні питання.

1. Про що свідчить позитивний результат РДА між еритроцитами та досліджуваним на наявність вірусу матеріалом?

2. Чи відбудеться реакція аглютинації еритроцитів, якщо до них додати вірус та відповідну сироватку?

Як називається реакція, яка виявляє цей феномен?

ПРАКТИЧНА РОБОТА №12.

Реакція зв'язування комплементу.

Реакція зв'язування компліменту (РСК) полягає в тому, що специфічний комплекс антиген — антитіло завжди адсорбує на собі (зв'язує) комплемент.

Цю реакцію широко застосовують при ідентифікації антигенів і в серодіагностиці інфекцій, особливо захворювань, викликаних спірохетами (реакція Вассермана), рикетсіями та вірусами.

РКС-складна серологічна реакція.

У ній беруть участь комплемент та дві системи антиген-антитіло. Фактично, це дві серологічні реакції.

Права система-основна складається з антигену та антитіла (один відомий, ін. ні). До неї додають певну кількість комплементу. За відповідністю антигену та антитіла цієї системи вони з'єднаються та зв'яжуть комплімент. Комплекс, що утворився, дрібнодисперсний і не видно.

Про утворення цього комплексу дізнаються за допомогою другої гемолітичної системи або індикаторної.

У неї входять еритроцити барана (антиген) і відповідна їм гемолітична сироватка (антитіло), тобто. готовий імунний комплекс. У цій системі лізис еритроцитів може статися лише у присутності комплементу. Якщо комплемент пов'язаний першою системою, то другий системі гемолізу нічого очікувати- т.к.

немає вільного комплементу. Відсутність гемолізу (вміст пробірки каламутний або на дні її осад еритроцитів) реєструють як позитивний результат РЗК.

Якщо першій системі антиген відповідає антитілу, то імунний комплекс не утворюється і комплімент залишиться вільним. Залишився вільним, комплімент бере участь у другій системі, викликаючи гемоліз, результат РСК негативний (вміст пробірок прозоро-"лакова кров").

Компоненти, реакції зв'язування комплементу:

Антиген - зазвичай лізат, екстракт, гаптен,

рідше завись мікроорганізмів.

2. Антитіло – сироватка хворого.

3. Комплемент – сироватка морських свинок.

Антиген – еритроцити барана.

5. Антитіло – гемолізин до еритроцитів барана.

6. Ізотонічний розчин.

Зважаючи на те, що в РСК бере участь велика кількість складних компонентів,

вони повинні бути попередньо відтитровані і взяті в реакцію в точних кількостях і в рівних обсягах: 0,5 або 0,25, рідше 0,2,1,25 або 1,0 мл (великі обсяги дають більш точний результат). Титрування компонентів реакції проводять у тому ж обсязі, в якому ставлять експеримент, замінюючи відсутні інгредієнти ізотонічним розчином.

Подібна інформація:

Пошук на сайті:

Заснована на тому, що еритроцити, на яких попередньо адсорбовані антигени, набувають здатності аглютинуватися у присутності гомологічних сироваток (антитіл).

Еритроцити виконують роль носіїв зі специфічними детермінантами, аглютинація яких відбувається в результаті реакції антиген + антитіло.

Еритроцити, до яких міцно приєднані антигени, називають еритроцитарним антигенним діагностикумом, або еритроцитами, сенсибілізованими антигеном.

Інший тип РНГА – на поверхні еритроцитів адсорбовані антитіла і подальша їх аглютинація відбувається у присутності гомологічного антигену.

У цьому випадку такі еритроцити називають еритроцитарним антитільним діагностикумом або еритроцитами, сенсибілізованими антитілами.

На основі цих двох принципових методичних підходів розроблено та використовується багато модифікацій РНГА. Так, як носії застосовують дрібні стандартні частинки латексу.

Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА)

В цьому випадку реакцію називають реакція латекс аглютинації (РЛА) або використовують золотистий стафілокок - реакція коаглютинації і т. д. Зазвичай еритроцитарні діагностикуми готують на підприємствах біологічної промисловості, а в діагностичних лабораторіях ставлять головний досвід РНГА.

Приготування еритроцитарних діагностикумів включає наступні етапи:

фіксація еритроцитів формальдегідом або глютаровим або акриловим альдегідами.
Такі оброблені еритроцити довго зберігаються. Найчастіше для цієї мети використовують еритроцити барана, людини, курей та ін;
обробка фіксованих еритроцитів розчином таніну В результаті еритроцити набувають властивість необоротно адсорбувати на своїй поверхні білки (віруси та антитіла);
сенсибілізація танізованих еритроцитів вірусами чи антитілами.

Слід зазначити, що методи приготування еритроцитарних діагностикумів для вірусних інфекцій різна.

Методика постановки РНГА для виявлення та визначення титру антитіл полягає в наступному:

до послідовних 2-кратних розведень сироватки додають рівні дози еритроцитів, сенсибілізованих антигеном;
суміш залишають на 2-3 години при кімнатній температурі або на 16-18 годин при 4 °С;
враховують результати.
Якщо в сироватці містяться антитіла до вірусу, яким сенсибілізували еритроцити, спостерігають гемаглютинацію, яку оцінюють у хрестах.

За титр антитіл у сироватці приймають найвище розведення сироватки, яке забезпечує гемаглютинацію не менше ніж на два хрести.

РНДА супроводжується всіма відповідними контролами. Зазвичай ставлять реакцію мікрометод.

РНГА дозволяє вирішувати такі діагностичні завдання:

виявити антитіла та визначити їх титр у сироватці крові за допомогою відомого еритроцитарного антигенного діагностикуму;
виявити та ідентифікувати невідомий вірус за допомогою відомого еритроцитарного антитільного діагностикуму.

Позитивні якості РНГА: висока чутливість, простота техніки постановки і швидкість відповіді.

Однак важливо відзначити, що виникають великі труднощі у приготуванні стабільних еритроцитарних діагностикумів (велика залежність від чистоти компонентів, що використовуються, необхідність підбору режиму фіксації, тонізації і сенсибілізації еритроцитів для кожного виду вірусу).

Якщо ви знайшли помилку, будь ласка, виділіть фрагмент тексту та натисніть Ctrl+Enter.

Вконтакте

Однокласники

У ній використовують еритроцити або синтетичні нейтральні матеріали (наприклад, частинки латексу), на поверхні яких сорбовані антигени (бактеріальні, вірусні, тканинні) або антитіла.

Їхня аглютинація відбувається при додаванні відповідних сироваток або антигенів. Еритроцити, сенсибілізовані антигенами, називають антигенним еритроцитарним діагностикумом і використовують для виявлення та титрування антитіл. Еритроцити, сенсибілізовані антитілами. називають імуноглобуліновими еритроцитарними діагностикумами та застосовують для виявлення антигенів.

Реакцію пасивної гемаглютинації використовують для діагностики захворювань, викликаних бактеріями (черевний тиф та паратифи, дизентерія, бруцельоз, чума, холера та ін.), найпростішими (малярія) та вірусами (грип, аденовірусні інфекції, вірусний гепатит В, кор, геморагічна лихоманка та ін.), а також для визначення деяких гормонів, виявлення підвищеної чутливості хворого до лікарським препаратамі гормонів, наприклад пеніциліну та інсуліну.

Реакція пасивної гемаглютинації (РПГА).

Реакція пасивної гемаглютинації є чутливим методом серологічної діагностики та використовується як для ранньої, так і для ретроспективної діагностики, а також для визначення імунопогічного стану щеплених. У хворих на туляремію антитіла зазвичай виявляються в кінці 1-го або на 2-му тижні захворювання, через 1-1,5 місяці титри РПГА досягають максимальних показників (1:100000- 1:20000, рідше вище), після чого знижуються і на рівні 1:100-1:200 зберігаються тривалий час.

У щеплених антитіла також виявляються постійно, однак у нижчих титрах, що не перевищують 1:2000-1:5000 через 1-1,5 місяці після вакцинації, зберігаються протягом декількох років на низькому рівні 1:20-1:80.

Антигеном для постановки РПГА є туляремійний еритроцитарний діагностикум (антигенний).

Препарат є формалінізованими еритроцитами барана, сенсибілізованими туляремійним антигеном, що випускається в рідкому і сухому вигляді. Рідкий препарат - 10% завись еритроцитів у розчині формаліну 10%-ної концентрації. Сухий ліофілізований препарат - висушена у вакуумі 10%-на суспензія еритроцитів без консерванту. Перед вживанням його розводять відповідно до вказівок на етикетці. Для постановки реакції в полістиролових пластинах обидва препарати застосовують в 2,5%-ної концентрації, а при постановці реакції в мікрооб'ємах - в 0,5%-ної концентрації.

Техніка постановки РПГА.

Випробувані сироватки розводять фізіологічним розчином 1:5 (1:10) і прогрівають при 56 ° С протягом 30 хвилин.

Реакція гемаглютинації (РДА) та

Після цього з метою видалення гетерогенних антитіл до баранячих еритроцитів, сироватки обробляють 50% суспензією формалінізованих баранячих еритроцитів. Для цього еритроцити додають із розрахунку 2 краплі (по 0,05 мл) на 1 мл сироватки і ретельно перемішують струшуванням.

Сироватку залишають до повного осідання еритроцитів або центрифугують після одногодинної витримки при кімнатній температурі, після чого вона готова до дослідження.

Рідина, що розводить, розливають в обсязі 0,5 мл в ряд лунок полістиролової пластини.

При попередньому дослідженні сироваток їх доцільно випробовувати шляхом постановки реакції короткому ряду пластини (6-лунок). У разі виявлення антитіл у короткому ряду сироватки повторно досліджують у довгому ряді розведень (12 лунок).

Після розливу рідини, що розводить, в першу лунку кожного ряду (короткого або довгого) додають по 0,5 мл випробуваних сироваток в розведенні 1:5. Потім у тих самих обсягах сироватки титрують дворазовими розведеннями. Таким чином, отримують розведення сироватки у короткому ряду з 1:10 до 1:320, а у довгому – з 1:10 до 1:20480. Після титрування сироваток в кожну лунку додають по одній краплі (0,05 мл) робочої 2,5% суспензії сенсибілізованих еритроцитів.

Вміст пластин ретельно струшують до отримання гомогенної суспензії. Пластини залишають за кімнатної температури на нерухомій поверхні столу. Попередній облік реакції проводять через 2-3 години, остаточне визначення титру проводять після повного осідання еритроцитів у лунках. До реакції передбачають такі контролі: 1) випробувана сироватка в розведенні 1:10 в обсязі 0,5 мл + 1 крапля 2,5% суспензії несенсибілізованих еритроцитів; 2) рідина, що розводить, в обсязі 0,5 мл + 1 крапля 2,5%-суспензії несенсибілізованих еритроцитів; 3) рідина, що розводить, в обсязі 0,5 мл + 1 крапля 2,5%-суспензії сенсибілізованих еритроцитів.

Усі контролі мають дати чітко негативну реакцію.

Облік та оцінка РПГА. Оцінку реакції проводять за такою схемою:

1) різко позитивна реакція (++++) - еритроцити випадають на дно лунки рівномірним шаром у вигляді парасольки, у якого нерідко спостерігається фестончасте обпливання країв;

2) позитивна реакція (+++) - еритроцити встеляють щонайменше 2/3 дна лунки;

3) слабопозитивна реакція (++) - аглютинат невеликий і розташований у самому центрі лунки;

4) сумнівна реакція (+) – навколо осаду еритроцитів у самому центрі лунки є окремі зерна аглютинату;

5) негативна (-) - на дні лунки еритроцити осідають у вигляді «гудзика» або маленького кільця з рівними, різко окресленими краями.

Титр сироватки враховують за останнім розведенням сироватки, яке дало цілком чітку реакцію (не менше трьох плюсів).

Діагностичним титром вважається розведення 1:100 і вище, однак, як і у разі РА необхідно простежити за його наростанням.

РПГА при туляремії є досить специфічною та виявляє деякі перехресні реакції лише з бруцельозними сироватками. Диференціальна діагностика можлива за висотою титрів у РПГА, які значно вищі з гомологічним антигеном.

Техніка постановки РПГА у мікрооб'ємах.

РПГА може бути виконана в мікрооб'ємах за допомогою мікротитратора типу Такачі (або круглодонних мікропланшетів з мікропіпетками), який дозволяє здійснювати титрування матеріалу обсягами 25 мкл і 50 мкл. Техніка постановки реакцій, послідовність всіх операцій така сама, як і при дослідженні в полістиролових пластинах. Слід, проте, пам'ятати, що чутливість микрометода зазвичай одне розведення (тобто.

вдвічі) нижче, ніж макрометода.

Для постановки реакції в мікротитраторі за допомогою піпетки - крапельниці в кожну лунку вносять рідину, що розводить, в обсязі 50 мкл. Потім за допомогою титроторів з головкою об'ємом 50 мкл забирають сироватку, що досліджується, занурюючи в неї головку.

Слід переконатись, що рідина заповнила голівку титратора. Титратор із сироваткою переносять у першу лунку і, тримаючи його у вертикальному положенні, роблять кілька обертальних рухів в обидві сторони. Потім титратор переносять наступну лунку і повторюють маніпуляцію. Титрування можна проводити одночасно у кількох рядах. Після титрування всього ряду титратор промивають дистильованою водою (зі зміною 2-х порцій) шляхом обертальних рухів, видаляють воду з голівки за допомогою тампона та обпалюють її на полум'ї пальника.

У лунки після титрування додають 25 мкл еритроцитарного діагностикуму.

Концентрація діагностикуму для РПГА в мікрооб'ємах повинна становити 0,5% (тобто 2,5% завись еритроцитів додатково розводять у 5 разів). Після додавання еритроцитів пластини слід трохи потрясти до отримання гомогенної суспензії. Облік результатів може бути зроблено вже через 1-1,5 години, у чому суттєва перевага РПГА у мікротитраторі.

Крім того, цей прийом вимагає малої кількості всіх інгредієнтів реакції та випробуваних сироваток.

Облік реакції проводять за такою схемою:

1) "+" - повноцінна гемаглютинація, при якій еритроцити випадають на дно лунки рівномірним шаром у вигляді "парасольки", що займає не менше 2/3 дна;

2) «+-« - часткова гемаглютинація, при якій еритроцити випадають на дно у вигляді пухкого кільця невеликого розміру;

3) «-« – відсутність гемаглютинації, коли еритроцити випадають на дно у вигляді маленького гудзика або кільця з рівним краєм.

Специфічність позитивного результату, отриманого в РПГА, може бути перевірена за допомогою трикомпонентної реакції – реакції торможення пасивної гемаглютинації (РТПГА).

Техніка постановки РТПГА.

Цю реакцію ставлять на підтвердження специфічності позитивного результату РПГА, що він викликає сумнів чи становить особливий епідеміологічний інтерес. Механізм реакції полягає у специфічному гальмуванні гемаглютинації при додаванні до випробуваної сироватці суспензії вбитих туляремійних бактерій. У реакції взаємодіють три компоненти: випробувана сироватка, специфічний антиген туляремійний і антигенний еритроцитарний діагностикум РТПГА зазвичай ставлять у ряду з 7-8 лунок.

Доцільно паралельно із РТПГА ставити повторну РПГА. У два ряди лунок розливають по 0,25 мл рідини, що розводить, потім в перші лунки обох рядів вносять випробувану сироватку в об'ємі 0,25 мл і виробляють титрування. Одержують два однакових ряду розведень сироватки. У всі лунки другого ряду додають по 0,25 мл рідини, що розводить, а в лунки першого ряду - по 0,25 мл суспензії туляремійних бактерій.

Використовують туляремійний діагностикум (що містить 25 млрд. туляремійних бактерій у 1 мл), попередньо розведений у 50 разів.

Така завись містить 500 млн. бактерій в 1 мл або 125 млн. в обсязі 0,25 мл. Після додавання антигену пластину залишають на 1 годину при кімнатній температурі, після чого всі лунки обох рядів додають по одній краплі (0,05 мл) еритроцитарного діагностикуму, пластину струшують і залишають на рівній поверхні столу.

Облік проводять через 2-3 години.

Облік та оцінка РТПГА. Якщо у випробуваній сироватці містяться специфічні туляремійні антитіла, вони нейтралізуються доданим антигеном і в першому ряду лунок гемаглютинації не відбудеться, або, при високому титрі сироватки, гемаглютинація буде відзначатись у меншій (на 2-4) кількості лунок, ніж у ряді. І тут специфічність результатів підтверджено.

Якщо ж гемаглютинація буде в обох рядах, тобто. результати РТПГА і РПГА співпадуть, це свідчить про відсутність у випробуваній сироватці туляремійних антитіл. У разі первинний результат РПГА визнається неспецифічним.

Техніка постановки РТПГА у мікрооб'ємах. РТПГА, як і РПГА, може бути виконана в мікрооб'ємах з використанням мікротитратора типу Такачі.

Для цього в лунки мікропластинок вносять по 0,25 мкл рідини, що розводить, в два ряди по 7-8 лунок в кожному. Потім за допомогою титратора забивають 0,25 мкл досліджуваної сироватки і титрують її в обох рядах. Після цього в перший ряд вносять по 25 мкл туляреміймого антигену (концентрація якого 500 млн. туляремійних бактерій в 1 мл) в кожну лунку, а в другий - 25 мкл рідини, що розводить.

Пластини залишають на 1 годину при кімнатній температурі, після чого до всіх лунок обох рядів додають 25 мкл антигенного зритроцитарного діагностикуму (0,5%-ної концентрації).

Облік та оцінку результатів проводять аналогічно реакції в макрооб'ємах.

Дата публікації: 2015-02-03; Прочитано: 3176 | Порушення авторського права сторінки

studopedia.org - Студопедія. Орг - 2014-2018 рік. (0.003 с) ...

1.Реакція гемаглютинації

(РДА)

метод виявлення та ідентифікації вірусів, заснований на наявності у деяких вірусів здатності вибірково аглютинувати еритроцити певних видів тварин.

В основі РДА лежить феномен склеювання еритроцитів, що відбувається під впливом різних факторів. Розрізняють пряму та непряму гемаглютинацію. При реакції прямої гемаглютинації відбувається склеювання еритроцитів при адсорбції певних антигенів, наприклад вірусів.

У серологічних дослідженнях застосовують реакцію гальмування прямої гемаглютинації, коли виділений у хворого вірус нейтралізують специфічною сироваткою імунної, а потім з'єднують з еритроцитами. Відсутність гемаглютинації говорить про відповідність вірусу та імунної сироватки.

Методика постановки реакції непрямої гемаглютинації складається з кількох етапів. Спочатку еритроцити відмивають ізотоничним розчином хлориду натрію, потім при необхідності (при використанні антигенів білкової природи) їх обробляють розчином таніну 1: 20000 і сенсибілізують розчинними антигенами. Після відмивання буферним ізотонічним розчином натрію хлориду еритроцитарний антиген готовий до вживання. Досліджувані сироватки розводять ізотоничним розчином хлориду натрію в пробірках або спеціальних пластмасових пластинках з ямочками, потім до кожного розведення сироватки додають еритроцитарний діагностикум. Результати реакції непрямої гемаглютинації враховують характером осаду еритроцитів, що утворився на дні пробірки. Позитивним вважають результат реакції, у якому еритроцити поступово покривають все дно пробірки. При негативній реакції еритроцити як маленького диска чи «гудзики» розташовуються у центрі дна пробірки.

Використання РДА

РГА використовується для індикації (виявлення) вірусів при проведенні орієнтовної діагностики, для титрування вірусів за гемаглютинуючими властивостями (встановлення гемаглютинуючих одиниць - АЕ).

Адсорбція вірусів

Основу феномену аглютинації, що викликається вірусами, становить адсорбція вірусів на поверхні еритроцитів, що супроводжується склеюванням (аглютинацією) останніх та випаданням в осад.

Антиген для РДА

Як антиген для РДА беруть будь-який матеріал (патматеріал у вигляді суспензії з органів, матеріал із заражених КЕ, культур тканини та ін), в якому передбачається наявність вірусу. Матеріал має бути рідким, без великих частинок.

Постановка орієнтовної РДА

Для постановки орієнтовної РДА на чисте і добре знежирене предметне скло наносять одну краплю матеріалу, що містить вірус, до неї додають одну краплю 5% суспензії еритроцитів і перемішують скляною паличкою.

Оцінка реакції РДА

Оцінюють реакцію у хрестах (плюсах). Оцінюючи реакції у хрестах звертають увагу до характер осаду. Якщо еритроцити осіли тонким шаром рівномірно по дну пробірки (у вигляді парасольки), реакцію оцінюють у чотири хрести

2. Реакція гальмування гемаглютинації- серологічна реакція, заснована на здатності антитіл запобігати аглютинації еритроцитів гемагглютинуючими видами вірусів (аденовірусами, арбовірусами, деякими ентеровірусами, вірусами грипу та парагрипу, кору, реовірусами). Специфічні антивірусні антитіла взаємодіють з поверхневими молекулами гемагглютинінів віріонів цих вірусів і блокують їх зв'язування з комплементарними молекулами мембрани еритроцитів.

Останнім часом реакція широко використовується в лабораторіях клінічної вірусології для визначення титрів специфічних антитіл до тих чи інших вірусів, а також серологічної ідентифікації та типування ізолятів вірусів з клінічного матеріалу від хворих. Використовують дещо обмежено через наявність у сироватці крові людей неспецифічних інгібіторів вірусів, а також природних антитіл - аглютинінів.

Реакція гальмування гемаглютинації (РТГА). Незважаючи на свою назву, принцип реакції багато в чому аналогічний РН вірусів, оскільки заснований на здатності AT пов'язувати різні віруси та нейтралізувати їх, позбавляючи можливості аглютинувати еритроцити. Візуально цей ефект і проявляється у «гальмуванні» гемаглютинації. РТГА застосовують при діагностиці вірусних інфекцій для виявлення специфічних антигемагглютинінів та ідентифікації різних вірусів за їх гемагглютиніном, що виявляє властивості Аг.

Реакція гальмування гемаглютинації

(РТГА)

метод ідентифікації вірусу або виявлення противірусних антитіл у сироватці крові хворого, заснований на феномені відсутності аглютинації еритроцитів препаратом, що містить вірус у присутності імунної до нього сироватки крові.

Реакція гальмування гемаглютинації. Механізм та практичне використання.

Багато вірусів мають здатність аглютинувати еритроцити строго певних видів ссавців та птахів. Так, віруси грипу та епідемічного паротиту аглютинують еритроцити курей, морських свинок, людини, а аденовіруси – еритроцити щурів, мишей. У зв'язку з цим для їх виявлення у матеріалі хворих або культурах клітин, ембріонів та тварин ставлять реакцію гемаглютинації(РДА). Для цього в лунках планшетів готують дворазово зростаючі розведення вірусомістких матеріалів і рідин, додаючи до них відмиті ізотонічним розчином суспензії NaCl еритроцитів. Для контролю спонтанної аглютинації еритроцити змішують з рівним обсягом ізотонічного розчину NaCl. Суміші інкубують у термостаті при температурі 37°З при кімнатній температурі.

Результати РДА враховують характером аглютинації еритроцитів через 30–60 хв, коли вони зазвичай повністю осідають у контролі. Позитивна реакція позначається плюсами. «++++» – осад у вигляді «парасольки», «+++» – осад з просвітами, «++» – осад з великими просвітами, «+» – пластівеподібний осад, оточений зоною скомкованих еритроцитів, та «–» - такий же різко окреслений осад еритроцитів у вигляді «гудзика», як і в контролі

Як групоспецифічна, РДА не дає можливості визначити видову приналежність вірусів. Їх ідентифікують за допомогою реакції гальмування гемаглютинації(РТГА). Для її постановки використовують свідомо відомі імунні противірусні сироватки, які в концентраціях, що вдвічі знижуються, розводять в ізотонічному розчині натрію хлориду і розливають по лунках. До кожного їх розведення додають рівну кількість вірусомісткої рідини. Контролем є завись вірусу в ізотонічному розчині натрію хлориду. Планшети із сумішшю сироваток і вірусу витримують у термостаті 30 хв або при кімнатній температурі 2 год, потім у кожну з них додають завись еритроцитів. Через 30 хв визначають титр віруснейтралізуючої сироватки (тобто максимальне її розведення), що спричинило затримку аглютинації еритроцитів.

Використовують РТГА у серологічній діагностиці вірусних хвороб, зокрема грипу та аденовірусних інфекцій. Ставити її краще так само, як і РН, із парними сироватками. Чотириразове наростання титру антитіл у другій сироватці підтверджує передбачуваний діагноз

3. Серологічне дослідженнядозволяє поставити діагноз у разі виявлення специфічних антитіл у сироватці хворих. Для серологічних реакцій використовують парні сироватки, які беруть у перші дні від початку захворювання та через 1 – 3 тижні, але вивчають одночасно. Діагностичне значення має наростання титру антитіл у 4 рази та більше. РТГА, РН, РСК, РТГадс, РІФ, РІА, ІФА ставлять з антигенами (діагностикуми), приготованими з еталонних штамів відповідних вірусів.

4. Парні – це означає, що кров двічі беруть із якимось інтервалом часу. За наростанням титру антитіл визначають, що зараження відбулося. Якщо титр антитіл не змінюється, то ці антитіла в організмі вже давно, свіжого зараження немає.

Найбільшу діагностичну цінність є дослідження парних сироваток, взятих від тварин на початку і в кінці захворювання (з проміжком в 14-21 день). Сироватку відбирають у стерильні пробірки та зберігають для дослідження.

Опис

Набір для діагностики парвовірусної хвороби свиней призначений для виявлення парвовірусного антигену в суспензії внутрішніх органів абортованих плодів у реакції гемаглютинації (РГА) та специфічних антитіл у сироватці крові свиней, а також новонароджених поросят (до прийому молозива) у реакції гальмування гемаггГА.

Реакцію ставлять мікрометодом у лунках полістиролових пластин.

полістиролові 96-лункові планшети для імунологічних реакцій;

антиген специфічний інактивований, що володіє гемаглютинуючою активністю не нижче 1:128;

сироватка специфічна, що має активність у РТГА не нижче 1:256;

сироватка нормальна (негативний контроль).

Час проведення аналізу:

РДА – 2,5-3,5 години, РТГА – 3,5-4,5 години (не враховуючи час підготовки матеріалів для дослідження).

Принцип методу:

Реакція гемаглютинації (РГА) заснована на склеюванні зважених у рідині еритроцитів під впливом гемаглютинуючих властивостей вірусу та утворення пухкого осаду у вигляді парасольки. Сутність РТГА полягає в нейтралізації гемаглютинуючих властивостей вірусу специфічними антитілами, що містяться в сироватці крові, внаслідок чого не відбувається склеювання еритроцитів і вони осідають на дно, утворюючи щільний осад у вигляді ґудзичка.

Умови зберігання

Набір зберігають у сухому місці, захищеному від світла, при температурі від 2 до 8°С.

Після розчинення компоненти набору можна зберігати у замороженому стані протягом 1 місяця, повторне заморожування не допускається.

Термін придатності

Еритроцити (або частинки латексу) з адсорбованими на них антигенами взаємодіють з відповідними антитілами сироватки крові, що викликає склеювання та випадання еритроцитів на дно пробірки або комірки у вигляді фестончастого осаду. При негативній реакції еритроцити осідають у вигляді ґудзичка.

Реакцію аглютинаціїможна проводити в мікроваріанті в осередках 96-лункового планшета для імунологічних досліджень із конічним дном. У лунки планшета вносять по 0,05 мл ФСБ (рН 7,2-7,4) і готують дворазове розведення випробуваних сироваток крові від 1:2 і вище. Потім кожну комірку вносять по 0,005 мл суспензії грибних клітин у концентрації 100 тис. грибних клітин на 1 мл. Планшет обережно струшують і витримують 2 години в термостаті за 37°С, а потім 16-18 годин - при 4°С. Як негативний контроль використовують нормальну (негативну) сироватку крові та ФСБ.

Результати реакції враховують за допомогою мікроскопа та візуально та визначають у хрестах за наступною схемою:

(++++) - повне просвітлення рідини та утворення аглютинату на дні лунки у вигляді перевернутого "парасольки", при струшуванні "парасолька" розбивається на пластівці;

(+++) - неповне просвітлення рідини та добре виражений "парасолька";

(++) - помітне просвітлення рідини, "парасолька" виражена помірно;

(+) - ледь помітне просвітлення рідини, "парасолька" виражена слабо;

(-) - Негативний результат, просвітлення рідини не настало, на дні лунки осад у вигляді ґудзика, при легкому струшуванні утворюється рівномірна завись.

За титр антитіл приймали останнє розведення випробуваної сироватки, в якому відбулася аглютинація не менше ніж у два хрести (++).